近年来，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域取得突破性进展，多个CAR-T免疫细胞疗法如anti-CD19和BCMA在血液肿瘤治疗中展现出良好效果。此外，基于AAV载体的基因疗法为罕见病患者带来了新的希望。与此同时，CRISPR基因编辑技术的发展标志着基因治疗进入一个新纪元，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，而体内基因编辑治疗也显示出积极的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题备受关注，其直接修改基因组DNA可能造成长期的风险。为此，FDA等监管机构提出了基因治疗安全性指导原则，主要有两个关注点：一是评估基因组完整性，包括染色体重排、大片段插入或缺失、外来DNA整合及潜在致癌性；二是识别脱靶编辑行为，包括其类型、频率和位置。

本篇将详细介绍各种脱靶检测技术。脱靶效应（Off-target effect）是指在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具不仅对目标序列进行修改，还可能不准确地影响其他相似的非目标位点，从而导致意想不到的基因组改变。为了保证基因编辑的安全性和有效性，各种检测方法陆续被开发。这些检测方法可分为两大类：

体内检测方法

体内检测方法在活细胞或生物体内对脱靶效应进行评估，通常更具生物学真实性。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是评估CRISPR-Cas9系统脱靶效应的强大工具。其原理在于引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物可插入Cas9产生的双链断裂点。通过高通量测序技术，研究人员能够全面识别潜在的脱靶位点。GUIDE-Seq因其高效与准确性，迅速成为评估基因编辑特异性的标准方法之一。

优缺点

优点：提供全基因组层面的脱靶位点信息；直接在活细胞中检测双链断裂事件；能够捕捉低频的脱靶事件。

缺点：实验操作较为复杂，需要较高的技术水平；难以检测未被标记物插入的脱靶位点；对于某些难转染的细胞类型，实施难度较大。

应用场景

基因治疗安全性评估：确保CRISPR编辑的精准性，避免临床过程中的脱靶风险。CRISPR工具优化：筛选高特异性的sgRNA或者改进Cas9变体。基础研究：研究DNA修复机制或CRISPR活性的调控因素，以及常规脱靶检测。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种新型的脱靶效应检测方法。该方法通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化，识别潜在的脱靶位点。由于能够直接在活细胞环境中进行操作，DISCOVER-Seq提供了更加真实的实验场景。

优缺点

优点：实时监测Cas9与DNA的相互作用，非侵入式检测手段；相比其他检测方法，具有更高的特异性和准确性。

缺点：实验设计复杂，需特定设备支持；不适用于某些难以转染的细胞类型；数据分析需专业知识支持。

应用场景

涵盖基础研究、临床前试验等领域，评估新开发的CRISPR工具的安全性，优化sgRNA设计，验证治疗策略的特异性和有效性。

体外检测方法

体外检测方法通常在实验室条件下使用生物提取成分或合成材料进行，精确控制特定因素。

Digenome-seq

Digenome-seq是高通量测序的脱靶效应检测方法。其通过在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9的切割作用，然后高通量测序以识别因Cas9切割而产生的双链断裂位点，找出潜在的脱靶位置。

优缺点

优点：能够无偏见地在全基因组范围内鉴定脱靶位点；提供比计算预测更高的准确性；操作相对简便。

缺点：可能遗漏仅在细胞内发生的脱靶事件；需要大量起始DNA及复杂的生物信息学支持。

应用场景

验证新设计的sgRNA的特异性、比较不同Cas9变体的效果，以及评估基于CRISPR治疗策略的安全性和有效性。

总结

在科研和临床应用中，CRISPR技术充满潜力与风险，脱靶现象尤为值得关注。尽管本文重点介绍了多种主流的CRISPR脱靶检测方法，每种方法都有其适用的场景与限制。在实际操作中，特别在临床试验中，充分评估CRISPR的脱靶风险需要多种检测方法的组合。如何有效评估及降低这种风险是未来研究的重要方向。

人生就是博科技在过去两年中构建了一站式基因编辑安全性评估平台，涵盖靶点设计、靶点筛选、GUIDE-seq及AID-seq等多种检测方法，提供高效、优质的服务。我们期待更多有效的检测手段涌现，从而进一步提升基因编辑技术的安全性与可靠性。